PIC＆RUN：集成检测和提取单个活性CTC细胞的综合方案
PIC＆RUN：集成检测和提取单个活性CTC细胞的综合方案
此外，由于CTC可以包含从多个活动性肿瘤病变中脱落的肿瘤细胞，因此有潜力帮助解决患者体内肿瘤异质性的复杂性。研究表明，CTC在多方面表现出高度的异质性。了解CTC的异质性将对理解转移和治疗耐药性产生深远影响。但是要弄清这种异质性，需要有工具来有效地单独分离可行的CTC，以便在单个细胞水平上对其进行分子和功能表征。
在该项研究中，研究者基于AccuCyte-RareCyte系统开发了一种使用阴性和阳性选择（PIC＆RUN）集成捕获和提取超纯单个活CTC的方案。如果需要转录组分析，则基于CSM为阳性选择模块处理样品，而如果需要离体培养和功能分析，则基于排除正常血细胞标志物使用阴性选择模块处理样品（图1a）。
图1 开发的PIC&RUN系统。(a) PIC&RUN实验说明。 (b)基于阳性或阴性选择方法的CTC检测
表1 阳性和阴性选择方法对活性CTC检测的敏感性
01 优化CTC阳性和阴性检测标记
该研究开发了两种检测AccuCyte buffy coats中活性CTC的策略。对于这两种策略， buffy coats均用抗免疫标记（IM）抗体混合物和抗CSM抗体组合（用于阳性选择方法）或活细胞染料（LCD）（用于阴性选择方法）进行活体染色。在该研究方法的优化过程中，使用EpCAM表达和缺乏IM信号来检测目标CTC。在阴性选择中，基于缺乏IM信号和Cell-Tracker绿色染色的表达而鉴定出CTC。
图2. PIC＆RUN分析用于CTC检测的评估（a）PIC＆RUN方法对CTC 检测的特异性（b）分离单个活CTC细胞
02 优化单个实时CTC细胞的提取
通过使用RareCyte针自动操作提取，该方案显示成功提取80％以上，一次提取中约有100至150个WBC交叉污染（图2b）。对于单细胞分子分析，单独分离CTC而不受其他细胞污染。通过第二次挑选步骤，成功提取了超纯单个CTC（图2b）。这种超纯的提取方案提供了以0.5μL最终体积与任何下游研究兼容的缓冲液或培养基提取纯的单个可行CTC的功能。
03 阳选CTC与单细胞转录组分析兼容
图3 单细胞RNA测序分析。 (a)采用阳性选择方案鉴定的单个CTC和免疫细胞的PCA图。 (b,c)基于CTC中上调基因的DEGs的IPA功能预测(b)或免疫细胞(c)。(d)处理后与对照CTC的PCA图
04 阴选CTC与离体培养兼容
在三个独立的实验中测试了阴性选择方法在离体培养中的适用性。对照组中单细胞克隆随时间的增殖曲线下面积（AUC）平均值明显高于Cell-Tracker green组（图4a），这种差异是由于在培养的第一周内，Tracker green +细胞的细胞增殖明显延迟所致。但在第2周和第3周的增殖速率与对照细胞相当（图4b）。Cell-Tracker绿色组中观察到的延迟可能是健康志愿者的血液对加标细胞的处理过程或免疫反应引起的。
图4 使用阴性选择分离的单个CTC的离体培养（a）在21天中阴性选择方案（Cell Tracker）分离的CTC单细胞克隆的曲线下面积（AUC）（b）来自三个独立实验的单细胞克隆随时间的增殖率
总之， PIC＆RUN方法是一种带有两个模块（阳性和阴性选择）来检测和分离活的单个CTC的新颖方法，可进行下游单细胞转录组学分析和离体培养单CTC。具有很高的灵敏度，能够检测到7.5毫升血液中的一个细胞。使用两步挑选程序，可以在单细胞分辨率下达到纯度，这是迄今为止在一个平台上检测和分离单个可行CTC的唯一方法。
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