综述：基于细胞液体活检RareCyte®平台评估蛋白质生物标志物和癌症基因组学

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综述：基于细胞液体活检RareCyte®平台评估蛋白质生物标志物和癌症基因组学

液体活检即血液取样，是一种非侵入性的方法，它可以生成以前只能从肿瘤组织活检中获得的信息。血浆中ctDNA片段分析在临床上用于检测基因变异和残留/复发的疾病，但不能评估癌症表型，包括药物靶点和蛋白生物标志物的表达。循环肿瘤细胞(CTCs)是进入血液的完整癌细胞，具有远处转移的潜能。检测CTC蛋白生物标志物，可以预测反应。此外，由于CTC包含完整的整个癌症基因组，治疗期间分离到活的CTC可以提供一个合理的方法来评估耐药性突变。CTCs的鉴定、表征和分子分析将提高液体活检的能力，以满足21世纪医学的要求。

方法和技术的进步使得对患者侵袭性越来越小的诊断方法能够进入组织：从肿瘤切除到切除活检、切口活检、核心针活检，然后细针穿刺活检。在21世纪，精确治疗是指导治疗的分子驱动和癌症分化器，因此在蛋白表达(药物靶标、生物标志物)和核酸序列水平上，活检样本需要更多的分子信息。

CTC计数与预后有关，但尚未被证明具有预测性：它可以给出治疗无效的早期指示(Lorente等人，2016)，但它不能确定哪种治疗有效。为了实现临床应用，CTC必须能够提供来自组织样本的分子信息类型—蛋白质生物标志物和核酸序列数据—这一点越来越受到关注(Keller和Pantel, 2019)。

对于单个CTC的蛋白和核酸生物标志物的分析，必须结合具有高分析敏感性和特异性的鉴定技术平台和确认为CTC细胞生物标志物的评估方法。研究一个以上生物标志物以增加关于癌症的信息深度，可能用于临床研究。此外，亚细胞分辨率成像能力使生物标记物能够定位隔层 (核，细胞质，膜)，这对理解细胞生理学很重要。最后，需要一种分离单个细胞的方法。RareCyte开发的平台和工作流程，结合了这些功能，以支持下一代基于细胞的液体活检应用(Campton等人,2015；Kaldjian等,2018)。

Rarecyte液体活检平台

根据差异密度将有核细胞从红细胞和血浆中分离出来，使血液样本中所有的CTC都可以集中出现，用于图像识别。如果CTC的检测被认为是“干草堆里的针”问题，RareCyte平台在没有选择偏差的情况下收集有核细胞的“干草堆”，然后使用高度敏感的自动免疫荧光显微镜来识别“针”。

蛋白质生物标志物的应用。

肿瘤特征

额外的生物标志物通道使研究已知具有临床意义的标记物或感兴趣的标记物成为可能。该平台的灵活性允许临床医生和研究人员选择相关的标记物。例如在胃肠道(GI)恶性肿瘤患者中，激素受体没有作用。然而，其他标记物引起了人们的高度关注，包括EGFR和HER2，在过去的几年中，围绕这两种标记物的药物开发非常激烈。通过血液采样评估该标记物的能力被证明是非常有用的，因为肿瘤可以随着时间的推移获得或失去HER2 (Burrell等人,2013)。

诊断确认

在一些临床情况下，由于风险、不经常的医疗检查、费用或无法获得先进技术，患者无法进行侵入性诊断程序，在这些情况下，常规组织活检是不可能的。例如，一些可疑的肺部影像学病变与癌症相一致的患者由于程序风险而不能进行支气管镜检查；其他临床症状与癌症一致的患者(如长期暴露于吸烟)可能无法获得用于诊断评估的标准成像；在全球卫生环境中，可能无法使用侵入性外科手术。通过血液样本检测CTC，其中包括组织起源的确证标记物(例如肺癌中的EGFR或乳腺癌和胃肠道恶性肿瘤中的HER2)，可能为癌症诊断和后续治疗的确证奠定良好的医学基础。

伴随诊断开发

基于CTC的液体活检可以在血液中的实际肿瘤细胞上评估治疗疗效的药物靶点和蛋白标志物，为非侵入性伴诊方法的发展提供一种合理方法。

肿瘤转化监测

谱系分化生物标志物可用于确定肿瘤从一种亚型向另一种亚型的转化。例如，上皮-间充质转化被认为是癌症进展和转移的一个重要方面。目前共识认为细胞很少是纯粹的间充质细胞，但通常在获得间充质细胞的同时保留一些上皮特征。通过在上皮细胞CTC实验中添加vimentin或N-cadherin等标记物，随后可转化为间充质表型。

药效学研究

在临床研究中，通过连续的肿瘤活检在分子水平上了解药物-靶点相互作用是非常困难的。然而，了解一种正在研究的药物是否对其治疗细胞产生有意义的作用是极其重要的。CTC生物标志物检测可以通过已知受药物作用调节的下游标志物评估药物活性。

非上皮性癌症

大多数关于CTC的研究是在上皮性肿瘤患者群体中进行的，上皮性肿瘤共同构成了大多数癌症。第一代CTC技术使用了上皮表面标记的抗体(通常是EpCAM和其他)从血液中捕获CTC，然后可以通过可视化的第二种常见上皮标记，如细胞角蛋白来确认。这在识别表达两种标记的CTC方面很有效，但并不是所有的癌症都是上皮性的(事实上，Ashworth在1869年报道的第一例循环肿瘤细胞是在一个肉瘤患者身上)，非上皮性癌症的CTC不能用上皮标记物检测出来。这一限制可以通过平台来克服，该平台可以灵活替代其他标记物来特定识别细胞类型。例如，RareCyte有合格的S-100、melan-A和NG2抗体，用于识别循环黑色素瘤细胞。

核酸测序的应用

靶向突变分析

cfDNA是循环肿瘤DNA (ctDNA)靶向测序最有效的方法。然而ctDNA分析并不总是成功的；等位基因片段和ctDNA的总量必须足以进行突变检测。CTC包含“纯粹的”癌症基因组，最大限度地减少等位基因分数对敏感性的影响。RareCyte平台已被用于检测转移性乳腺癌患者血浆中未检测到的CTC中PIK3CA突变(Liu等，2020)。

WGS/WES测序

CTC包含完整的癌症基因组，使全基因组测序可以用于广泛的突变检测。RareCyte平台与全外显子组测序一起使用，在9个月的时间里跟踪三阴性乳腺癌中CTC的基因组进化(Kaldjian等人,2018年)。由于基因组扩增的方法不断改进，这种方法可能会变得更加普遍。

突破/耐药克隆检测

凋亡细胞释放ctDNA，可以在血浆中检测到短片段，用以检测突变。耐药克隆可能只占整个肿瘤的一小部分，而且它们不太可能发生凋亡，因此它们的基因组可能无法在目前cfDNA检测灵敏度的极限下被检测到。当患者正在接受治疗时，可以对存在的CTC进行识别、分离和测序，以在耐药人群中找到基因突变，而在大部分肿瘤中不存在，以指导后续治疗的计划。

肿瘤细胞的异质性

ctDNA分析可以评估大量肿瘤细胞的突变异质性，但不能解决单个细胞内的突变概况。异质性是由突变的不同变异等位基因组分的存在推断出来的，这些变异往往是亚克隆的(Misale, et al.，2014)。由于CTC可以单独测序，它们可能更好地反映获得不同抗性机制的克隆之间的可变性。因此CTC更适合在细胞水平上研究异质性。

临床应用

CTC计数和生物标志物分析

在一项晚期胃肠道肿瘤患者的临床研究中，在治疗期间对CTC进行计数和跟踪。