CANCER-ID联盟评估CTC处理和检测方法技术性能的能力验证

CANCER-ID联盟评估CTC处理和检测方法技术性能的能力验证

研究背景

循环肿瘤细胞(CTCs)是一种已经进入血液的癌细胞，可以在外周血中检测到，其检测技术多种多样，但目前尚缺乏评价其技术性能的标准。这限制了CTC分析在临床常规中的适用性。从15年前引入CellSearch系统以来，已有40多个CTC检测系统投入商业使用。鉴于个性化医疗的治疗预测前景，全球CTC市场的预测非常乐观，复合年增长率高达23%，预计到2023年底，全球市场价值将达到280亿美元左右。令人惊讶的是，几乎所有可用的CTC技术（CellSearch系统除外）都没有进行大型的多中心试验来证明其临床有效性，这是测试预测价值或甚至其常规临床使用的更复杂试验的基本要求。然而，每一种CTC检测方法在展示临床效用的道路上的一个重要步骤是首先确定其技术的有效性。对于大多数技术开发者来说，这是一项复杂、耗时和昂贵的任务，似乎更具有挑战性。这种困境以及支持当前和未来的CTC技术开发商的愿望引发了建立一个可持续的能力测试平台的想法，以确定CTC检测方法的技术性能基准，并允许独立比较不同的技术。

该能力测试平台是在创新药物倡议（IMI）联盟CANCER-ID的框架内开发的，旨在测试分析前样品处理和检测NSCLC中CTCs作为血液生物标志物的标准操作程序（SOP）。NSCLC患者的治疗选择越来越多，这就需要生物标志物来对患者进行分层和/或监测患者的反应。在这种情况下，CTCs可能是满足这一需求的宝贵的肿瘤材料来源；然而，由于其稀有性和潜在的表型异质性，检测NSCLC CTCs仍然是一项重大挑战。在此，我们展示了这个CTC富集/分离/检测技术能力测试平台的第一个结果。

材料和方法

测试了五种富集CTC的方法：CellSearch®系统 (Menarini Silicon Biosystems)；VyCAP Microsieves (VyCAP)；Siemens过滤装置(Siemens，原型是非卖品)；Parsortix®(ANGLE)和RareCyte平台(RareCyte)，使用一致的sop。所有技术中，免疫荧光染色和荧光显微镜成像检测富集后的加标细胞。结果通过在线问卷进行报告，该问卷通过卢森堡综合生物样本库(IBBL)生物标本能力验证项目的安全网络报告工具提供给各网站。

研究结果

选择NCI-H441和NCI-H1563肺癌细胞系进行环试验的基本原理

测试平台旨在提供2个EpCAM表达差异较大的肺癌细胞株，常被用作CTC标记依赖性富集的细胞表面抗原。目标是鉴定符合3个标准的细胞株:1)所有细胞株都应该表达细胞角蛋白(CK)，因为它已经成为免疫染色鉴定CTC的标准标记;2)细胞系EpCAM差异表达，检测标志物依赖平台和非标志物独立平台;3)细胞株细胞大小应不同，采用大小依赖法进行试验。选择一个EpCAM高表达细胞系(NCI-H411)和一个EpCAM低表达细胞系(HCI-H1563)，而且这两种细胞株在KRAS、TP53和EGFR基因中均具有独特的突变模式，且具有较高的基因组相似性。

使用不同的技术恢复加标细胞

为了测试5种CTC富集方法，共98个样品在中央实验室(IBBL，卢森堡)制备，并运往6个国家的9个参与地点(德国，法国，比利时，荷兰，瑞士，意大利)，每个样本加入的细胞数量范围从51到99，不同技术的样品间差异不显著。在所有加标实验中，NCI-H441的平均存活率为95.1%(范围:91.8%-98.4%)，NCI-H1563的平均存活率为96.6%(范围:93.0%-98.1%)，在实验期间，未观察到细胞大小的显著变化。

正如预期的那样，EpCAM低表达的NCI-H1563细胞无法被CellSearch检测到，因此被排除在测试之外。对于NCI-H441细胞，使用Parsortix(平均值:71%)、CellSearch(平均值:75%)和RareCyte(平均值:68%)系统回收率显著高于Siemens(平均值:54%)和VyCAP(平均值:49%)系统。

对于NCI-H1563细胞，使用Parsortix （平均：67%）和RareCyte（平均：76%）回收率明显高于VyCAP Microsieves（平均：32%）RareCyte的回收率也明显高于Siemens的回收率（平均：56%）。在基于尺寸的技术中， NCI-H441和NCI-H1653两细胞回收率没有任何统计学意义上的差异。

不同技术扫描、鉴定细胞的代表图片

不同技术下加标细胞的总体回收情况

研究结论

在这项多中心研究中，建立了一个平台使CTC富集/分离/检测方法的技术基准化。该平台是在欧洲创新药物倡议（IMI）联盟CANCER-ID的框架内建立的，来自欧洲和美国的学术、临床和工业基地的科学家们在液体活检领域的创新技术方面进行了合作。目前，有越来越多的技术可用于CTC检测，其性能和在多个真实实验室中的可重复性是很难推断的，因为所有可用的数据都是分散的，相当难以比较，因此很难推断出它们在多个实际实验室中的性能和可重复性。面对这种情况，CANCER-ID平台的建立是为了产生多种技术的比较数据，并作为技术开发商的工具，在多个学术场所使用标准化的样本评估其技术性能特征和标准操作程序（SOP）。

对于实验室的日常工作，样品管理的实用性和分析的吞吐量是最重要的。在这种情况下，推荐带固定溶液的BCT对于灵活的样品运送和高效的样品处理是一个重要的问题。虽然BCT固定剂增加了样品的稳定性，但值得注意的是，也损害了CTC的下游基因表达分析。BCTs的保存时间在3—5天之间，在常规使用前需要考虑。另一个重要问题是暂停工作流程的可能性。测试的大多数工作流程要求所有步骤都要连续执行，包括基于显微镜的检测，以避免荧光染料褪色。例外是RareCyte制作样本允许长期存储处理在-20℃最多保存1年，这可以增加研究设计或样本管理的灵活性。

在临床上实施这些检测方法，另一个可预见的重要问题是对结果的适当记录。在这方面CellSearch和RareCyte系统明显领先于所有其他测试技术，它可以对整个富集的细胞部分进行自动显微扫描，并使不同的用户随后对CTCs进行软件辅助识别成为可能。

综上，选择最佳的CTC富集方法是具有挑战性的，在这一领域缺乏标准化和实验室间测试的数据，对方法的技术重复性提出了问题。此外，由于前分析条件、方案、细胞模型和患者样本的不同，不同研究的结果比较受到阻碍，这也对结果的可重复性提出了问题。该平台和由CANCER-ID建立的跨国环试验旨在通过使用集中准备的样本、一致的标准操作规程和统一的报告系统来解决这些问题，CTC的环形测试平台并不打算取代技术供应商证明其技术能力的努力，而是提供可靠的分析重复性信息。