抗氧化剂NAC通过减轻细胞应激反应促进单个循环肿瘤细胞的体外生长和扩张

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循环肿瘤细胞(CTCs)可以通过微创采血分离出来，被认为是原始实体肿瘤的“液体活检”。CTCs包含一小部分转移前体，可在次要器官形成转移，并为识别潜在转移起始特性的机制提供了资源。尽管技术进步允许采用高度敏感的检测和分离方法，但CTC稀有性，通常以单细胞形式出现，这对分离后的体外扩张构成了极大挑战。一方面CTCs是异源性的，具有不同的EMT和干细胞状态。CTC系可以在培养中长期维持，但当分离并作为单细胞培养时，大部分都很难成功扩增。另一方面建立CTCs体外培养效率极低，限制了其在大多数癌症患者中的广泛应用。这种低效率可能是由于数量有限、捕获效率低、程序苛刻以及CTC在流通中的脆弱性。为了从功能上了解患者内部的CTCs异质性，建立来自个别病人的多个CTC克隆将是非常有用的。

本文要点

1. 我们将单个CTCs作为一个平台来筛选小分子药物库，以确定可以提高单个CTC离体培养效率的化合物。发现N-乙酰半胱氨酸(NAC)和其他抗氧化剂可以通过减少氧化和其他应激，特别是在单细胞扩张的初始阶段，促进单个CTCs的体外扩张。

2. 生长克隆和非生长克隆的RNA-seq分析证实了NAC的作用，但也表明NAC诱导的氧化应激降低不足以促进具有明显衰老特征的细胞亚群的增殖。在扩大所有CTC方面存在挑战，但NAC治疗导致了具有类似致瘤特征的单个CTC克隆建立。

因此通过小分子筛选和验证研究发现NAC可以通过减轻初始应激来提高单个CTC的体外扩增成功率，还有可能促进CTC功能异质性的研究。

研究结果

1. 两轮结果汇总

3个患者来源的CTC系(BRx68、BRx07和BRx50)和DMSO对照品，并用代号盲测化合物。初步低信度筛选到16种候选化合物和常用的300μM的抗氧化剂NAC在促进单个CTC增殖方面表现明显，用于进一步验证。在4个患者来源的CTC株系(BRx07、BRx42、BRx50和BRx68)中使用36种不同浓度或组合进行验证。与对照相比，NAC、NAC+P1C2始终显示出统计上显著性改善。对于BRx50和BRx42株系来说，它们很难作为单细胞扩增，这些化合物的添加可以成功地产生单细胞克隆。

2. NAC单细胞克隆形成肿瘤的动力学与对照相似

研究注意到最关键的阶段是单个CTC的初始扩增。一旦单细胞菌落达到临界大小，用这些化合物(NAC或NAC+P1C2)处理似乎不会带来额外的生长优势。因此，24天后停止这些化合物的处理，并延长培养时间，产生多个单细胞克隆。NAC处理克隆产生的肿瘤具有相似的生长动力学和组织学，表明短期NAC治疗对CTCs的致瘤性没有显著影响。

3. NAC挽救了从乳腺癌患者中新分离的CTCs的增殖

使用AccuCyte样本收集系统(RareCyte)分离单个活CTCs。用免疫细胞标记抗体(CD45, CD14和CD16)和cell-tracker green染色，并使用RareCyte仪器进行半自动扫描并提取感兴趣的细胞。从一名乳腺癌患者的一管血液中分离出两个单一的CTCs，分别培养在不同常规培养基中。然而两周后不久，两个克隆体的细胞开始死亡。为了拯救这些克隆细胞，换用含NAC的培养基培养。其中一个克隆细胞恢复并继续增殖约5周，形成一个大的细胞集落。为了确认这些克隆是癌细胞，从克隆2中分离出来8个单细胞在NAC下培养12周后进行拷贝数变异(CNV)分析。所有细胞的CNV谱显示出与癌细胞相似的整体异常并且它们整体CNV模式惊人的相似，表明所有8个细胞都是由单个细胞进化而来。